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  我國學(xué)者開發(fā)出高效微型CRISPR-SpaCas12f1基因編輯系統(tǒng)
  
  2022-09-30 來源：中國生物技術(shù)網(wǎng)
  
  上?？萍即髮W(xué)季泉江教授團隊在Cell Reports發(fā)表了題為 “Guide RNA engineering enables efficient CRISPR editing with a miniature Syntrophomonas palmitatica Cas12f1 nuclease”的研究論文。
  
  該論文報道了Syntrophomonas palmitatica Cas12f1（SpaCas12f1）的生化特征及DNA切割機制，證明CRISPR-SpaCas12f1系統(tǒng)能在細菌中實現(xiàn)多種編輯目的，且通過工程化向?qū)NA使該系統(tǒng)轉(zhuǎn)化為哺乳動物細胞中高效的基因組編輯器。
  
  CRISPR-Cas系統(tǒng)是目前常用的基因編輯工具，但是由于傳統(tǒng)的Cas核酸酶分子量普遍太大，使其在在體基因治療的應(yīng)用中受限。近年來，為了解決這一難題，小的Cas核酸酶逐漸被發(fā)現(xiàn)和探究。其中，Cas12f 核酸酶是目前緊湊的 CRISPR 效應(yīng)核酸酶，比傳統(tǒng)Cas9和Cas12a核酸酶小一半以上，在臨床治療應(yīng)用中具有巨大潛力，然而高效的Cas12f基因編輯系統(tǒng)仍舊較少。
  
  圖1.CRISPR-SpaCas12f1的表征與改造
  
  來自Syntrophomonas palmitatica的緊湊型SpaCas12f1只有497個氨基酸，該研究首先系統(tǒng)地表征了SpaCas12f1的生化特性及對DNA識別與切割的模式，證明了SpaCas12f1是一種鎂離子依賴的嗜熱核酸酶，可在tracrRNA和crRNA的幫助下有效切割含有5' -NTTY (Y代表C或T)PAM的雙鏈DNA。此外，SpaCas12f1擁有與AsCas12f1相似的切割模式，即在靶向鏈上引入一個切口，非靶向鏈上引入兩個切口（圖1）。
  
  由于SpaCas12f1在大腸桿菌中擁有質(zhì)粒干擾活性，為探究其能否成為一個在細菌中高效的基因組編輯工具，研究人員通過引入SpaCas12f1和Lambda Red重組酶系統(tǒng)及單鏈修復(fù)模板，實現(xiàn)了CRISPR-SpaCas12f1在大腸桿菌（Escherichia coli）和肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）中多種精準(zhǔn)的基因組編輯。同時，研究人員發(fā)現(xiàn)SpaCas12f1的tracrRNA具有獨特的head-to-toe的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，這是限制SpaCas12f1在哺乳動物細胞有效編輯的主要因素。通過對RNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測及小RNA測序結(jié)果分析，研究人員設(shè)計了五種策略，系統(tǒng)地工程化向?qū)NA，成功地獲得了高效的引導(dǎo)RNA，gRNA_MS13，從而實現(xiàn)CRISPR-SpaCas12f1高效哺乳動物細胞編輯。
  
  這項研究擴展了微型CRISPR核酸酶工具庫，并為基因治療和工程化微型CRISPR系統(tǒng)提供了新的思路。
  
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