圖為一個(gè)盛開著罌粟花的大腦，罌粟是阿片類鎮(zhèn)痛藥的重要來源。罌粟花上有一只青蛙，表示本研究中使用了來自青蛙皮膚表面的皮啡肽。圖像右側(cè)是四個(gè)被激活的阿片受體的結(jié)構(gòu)被嵌在細(xì)胞膜內(nèi)。來自罌粟中的阿片物質(zhì)模擬了人體內(nèi)的阿片肽功能，均通過結(jié)合阿片受體來調(diào)控人體內(nèi)鎮(zhèn)痛、感知、獎(jiǎng)賞等生理活動(dòng)。本研究報(bào)道了整個(gè)阿片受體家族結(jié)合內(nèi)源性多肽，以及DOR和青蛙皮膚表面的外源皮啡肽的三維結(jié)構(gòu)。
內(nèi)源阿片系統(tǒng)由四個(gè)阿片受體成員以及一系列阿片肽組成，廣泛分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、外周神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)中，調(diào)控鎮(zhèn)痛、欣快、獎(jiǎng)賞、認(rèn)知、應(yīng)激等信號(hào)通路，是臨床用于治療疼痛、焦慮等疾病的重要靶標(biāo)。
阿片受體家族共有四個(gè)成員，分別為μOR、δOR、κOR、NOPR，均屬于G蛋白偶聯(lián)受體，主要通過偶聯(lián)下游Gi蛋白發(fā)揮功能。阿片受體不僅會(huì)被體內(nèi)產(chǎn)生的阿片肽激活，也會(huì)被外源的阿片類/非阿片類藥物激活，包括廣為人知的嗎啡、芬太尼等藥物。在2022年11月10號(hào)的Cell期刊上，徐華強(qiáng)研究員/莊友文副研究員團(tuán)隊(duì)聯(lián)合謝欣研究員團(tuán)隊(duì)、王明偉教授團(tuán)隊(duì)，一次報(bào)道了嗎啡和芬太尼結(jié)合人源μOR-Gi蛋白信號(hào)復(fù)合體的結(jié)構(gòu)，揭示了兩者在結(jié)合μ型阿片受體上的關(guān)鍵差異因素。
靶向μOR的小分子阿片藥物廣泛用于臨床中至重度的急性疼痛，然而它們?cè)趶?qiáng)效鎮(zhèn)痛的同時(shí)也伴隨著耐藥、呼吸抑制、成癮等諸多嚴(yán)重的副作用。為了開發(fā)更低毒副作用的鎮(zhèn)痛類藥物，科研人員將目光聚焦到了其它亞型阿片受體的激動(dòng)劑上，成功促進(jìn)了一些鎮(zhèn)痛藥物的研發(fā)，包括靶向κOR的地佐辛、鹽酸噴他佐辛酯、納布啡癸二酸，氫溴酸依他佐辛等上市藥物，靶向δOR的SRI-22138、BMS986187等臨床在研藥物，靶向NOPR的PPL-138、LY-2940094等臨床在研藥物（源于藥渡數(shù)據(jù)）。盡管有了很大的進(jìn)展，由于小分子藥物較差的選擇性和藥理活性，還是引發(fā)了其他副作用：致幻、驚厥、癲癇等，導(dǎo)致它們的臨床進(jìn)展受到了阻礙、甚至被終止。
人體中的阿片肽不僅是強(qiáng)效鎮(zhèn)痛藥嗎啡等外源阿片藥物的天然模板，而且在機(jī)體自身分泌的濃度下不導(dǎo)致成癮、呼吸抑制等副作用，內(nèi)源性的阿片肽對(duì)四種阿片受體具有很高的親和力以及激動(dòng)活性，重要的是具有高度選擇性，這些特性賦予了它們重要的研發(fā)價(jià)值。近幾年隨著那句“少年只知多巴胺，中年才懂內(nèi)啡肽”網(wǎng)絡(luò)名言的廣為流傳，刺激內(nèi)啡肽生成的勵(lì)志活動(dòng)被逐漸推廣。內(nèi)啡肽是阿片肽眾多成員中的一種多肽神經(jīng)遞質(zhì)，它會(huì)在身體感到疼痛或者有壓力時(shí)被釋放，有助于減輕疼痛、緩解壓力，內(nèi)啡肽也會(huì)在按摩、跑步、游泳等鍛煉運(yùn)動(dòng)中被釋放，通過機(jī)體的獎(jiǎng)賞信號(hào)通路來提升人的幸福感。阿片肽由一系列前體蛋白經(jīng)過酶解和修飾得到，包括內(nèi)啡肽、強(qiáng)啡肽、腦啡肽和痛敏肽等。除了內(nèi)源性的阿片肽以外，阿片受體也會(huì)被外源的多肽激活，包括食物中的酪啡肽、青蛙皮膚表面的皮啡肽等。
隨著X-射線晶體技術(shù)和冷凍電鏡技術(shù)的發(fā)展，在近20年間，已經(jīng)有超過800個(gè)GPCR相關(guān)的結(jié)構(gòu)被報(bào)道（源于GPCRdb），阿片受體作為舉足輕重的一類藥物靶標(biāo)，該家族的失活和激活結(jié)構(gòu)也被相繼發(fā)表，在之前的研究中，很多備受關(guān)注的科學(xué)問題得以解釋，包括阿片受體與小分子拮抗劑/激動(dòng)劑的結(jié)合模式，鈉離子口袋介導(dǎo)的激活機(jī)制，μOR的偏向性機(jī)制等。然而，內(nèi)源性阿片肽配體如何選擇性識(shí)別并激活不同亞型阿片受體的分子機(jī)制尚不清楚，阻礙了科研人員對(duì)阿片肽的認(rèn)知與合理的設(shè)計(jì)改造。
2023年1月12日，中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所徐華強(qiáng)/莊友文團(tuán)隊(duì)聯(lián)合美國(guó)北卡羅萊納大學(xué)教堂山分校Bryan L. Roth團(tuán)隊(duì)合作在國(guó)際期刊Cell上以長(zhǎng)文形式在線發(fā)表了題為“Structures of the entire human opioid receptor family”的研究論文。該項(xiàng)研究系統(tǒng)地分析和明確了各內(nèi)源性阿片肽對(duì)阿片受體的信號(hào)活性，并進(jìn)一步解析了阿片受體家族四個(gè)亞型μOR、δOR、κOR、NOPR和各自的選擇性阿片肽包括內(nèi)啡肽、內(nèi)嗎啡肽、強(qiáng)啡肽、皮啡肽和痛敏肽的冷凍電鏡復(fù)合物結(jié)構(gòu)，結(jié)合大量細(xì)胞水平的功能實(shí)驗(yàn)，揭示了多肽類配體和阿片受體的結(jié)合模式，闡述了它們的選擇性和保守性機(jī)制，為“信使-信箱-效能”模式提供了結(jié)構(gòu)和功能支持。
在本項(xiàng)研究中，研究人員首先通過細(xì)胞水平的功能實(shí)驗(yàn)，較為系統(tǒng)地分析了阿片肽對(duì)野生型阿片受體的的信號(hào)傳導(dǎo)特性。由于內(nèi)啡肽和腦啡肽對(duì)μOR、δOR的激活程度相近，為了系統(tǒng)地闡述選擇性差異，研究人員終鎖定了內(nèi)啡肽以及選擇性更顯著的內(nèi)嗎啡肽、強(qiáng)啡肽、痛敏肽和外源的皮啡肽作為研究對(duì)象，分別解析了內(nèi)啡肽-μOR、內(nèi)嗎啡肽-μOR、強(qiáng)啡肽-κOR、痛敏肽-NOPR，皮啡肽-δOR的高分辨率冷凍電鏡三維結(jié)構(gòu)，并用第二信使cAMP的抑制試驗(yàn)、G蛋白和arrestin蛋白的招募實(shí)驗(yàn)來分析突變體的特性。
圖1. 阿片受體結(jié)合阿片肽的功能實(shí)驗(yàn)和冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。A：阿片肽誘導(dǎo)阿片受體激活的親和力，B：cAMP抑制曲線結(jié)果，C：Gi招募實(shí)驗(yàn)的曲線結(jié)果，D-H：阿片受體結(jié)合阿片肽的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)和原子模型。
研究發(fā)現(xiàn)，所有的阿片肽都是以N端插入的方式進(jìn)入受體，阿片肽的N端基序YGGF（痛敏肽是FGGF）“信使”結(jié)合在阿片受體極為保守的正構(gòu)結(jié)合口袋腔室里，一個(gè)酪氨酸/苯丙氨酸主鏈上的胺基均與D3.32Q2.60Y7.43基序形成極性網(wǎng)絡(luò)，該保守腔室對(duì)配體的識(shí)別和藥理活性是必不可少的，合成的YGGF四肽便可以通過較弱的作用激活四個(gè)受體（EC50約10μM）。結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，阿片受體的胞外端，主要為ECL2/3以及TM2/6/7的胞外端在序列和帶電性上都具有差異性，比如κOR和NOPR的ECL2富含帶負(fù)電的氨基酸，對(duì)應(yīng)的強(qiáng)啡肽和痛敏肽在ECL2處富含帶正電的氨基酸。大規(guī)模功能突變實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，阿片受體ECL2/3和TM2/6/7的胞外端序列不保守性和帶電差異性共同決定著阿片受體對(duì)阿片肽的選擇性結(jié)合。
NOPR是阿片受體家族中一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的受體，沒有被冠以希臘字母名稱，本研究解析的痛敏肽結(jié)合NOPR的結(jié)構(gòu)，也是一個(gè)激活形式NOPR的結(jié)構(gòu)，通過結(jié)構(gòu)比對(duì)分析，不出意外地發(fā)現(xiàn)它遵循阿片受體通用的激活機(jī)制。除此之外，阿片受體對(duì)于下游Gi蛋白有著極高的選擇性，本研究發(fā)現(xiàn)阿片受體的ICL3會(huì)形成一個(gè)短的α螺旋與Gi形成疏水作用，同時(shí)保守的精氨酸與Gi形成靜電作用。這也可以部分解釋Gi結(jié)合的GPCR結(jié)構(gòu)都含有完整的ICL3，而與其他亞型G蛋白（Gs，Gq）結(jié)合的GPCR結(jié)構(gòu)中往往缺失了ICL3的電子云密度的原因。
綜上所述，研究團(tuán)隊(duì)通過解析阿片肽結(jié)合的阿片受體結(jié)構(gòu)，系統(tǒng)地闡釋了多肽配體的結(jié)合模式，揭示了阿片受體中保守的結(jié)合口袋以及獨(dú)特的ECL2/3共同介導(dǎo)阿片肽的作用機(jī)制，闡明了阿片受體通用的激活機(jī)制以及對(duì)下游Gi蛋白的選擇性特征。這些工作為理解阿片系統(tǒng)的生物學(xué)特性提供了夯實(shí)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，為設(shè)計(jì)新型高效的阿片肽類鎮(zhèn)痛藥物鋪平了道路。
圖2. 阿片受體和阿片肽的選擇以及“信使-信箱”概念的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
本研究冷凍電鏡數(shù)據(jù)在上海藥物所高峰電鏡中心和上海藥物所冷凍電鏡平臺(tái)收集。中國(guó)科學(xué)院上海藥物所博士研究生王悅、副研究員莊友文、北卡羅來納大學(xué)教堂山分校Jeffery F. DiBerto為該論文的共同作者。上海藥物所徐華強(qiáng)研究員、莊友文副研究員，以及北卡羅來納大學(xué)教堂山分校Bryan L. Roth教授為論文的共同通訊作者。參與本次研究的還有上海藥物所碩士畢業(yè)生劉衛(wèi)一、高峰電鏡中心執(zhí)行主任袁青寧，美國(guó)溫安洛研究所Karsten Melcher教授和X. Edward Zhou博士等。該工作獲得了國(guó)家自然科學(xué)基金委、科技部重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、上海市科技重大專項(xiàng)、中科院特別助理研究項(xiàng)目以及美國(guó)國(guó)立心理健康研究院、國(guó)立衛(wèi)生研究院等的項(xiàng)目經(jīng)費(fèi)資助。
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