上科大新研究或可提高CAR-T治療實體腫瘤療效
CAR-T細(xì)胞耗竭一直是困擾CAR-T療法的難題。
3月8日，上?？萍即髮W(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院王皞鵬課題組與復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院吳海濤團(tuán)隊、中科院分子細(xì)胞科學(xué)創(chuàng)新中心許琛琦實驗室，以及上海市第一人民醫(yī)院宋獻(xiàn)民課題組合作在國際期刊《細(xì)胞研究》（Cell Research）（影響因子：46）上發(fā)表了題為《調(diào)節(jié)嵌合抗原受體（CAR）的電荷密度可優(yōu)化基底信號傳導(dǎo)和CAR-T細(xì)胞適應(yīng)性》（Tuning Charge Density of Chimeric Antigen Receptor Optimizes Tonic Signaling and CAR-T Cell Fitness）的研究論文。該研究成功解析了基底信號（Tonic signaling）形成的機制——CAR胞外區(qū)域表面帶正電荷的斑塊（PCPs）介導(dǎo)CAR自發(fā)聚集，從而產(chǎn)生基底信號。據(jù)此，研究團(tuán)隊提出了兩種新的優(yōu)化CAR的思路：在體外CAR-T擴增期間提高培養(yǎng)基中的鈉鹽離子濃度，或基因改造引入改變PCPs的突變。
論文截圖。
據(jù)稱，這一發(fā)現(xiàn)可顯著緩解CAR-T細(xì)胞耗竭，進(jìn)而提高CAR-T治療實體腫瘤的效果?！拔覀兊倪@個發(fā)現(xiàn)可以指導(dǎo)臨床上所有CAR的優(yōu)化，我們可以告訴你一個CAR有沒有基底信號，有的話是多少，它的基底信號是否處在較優(yōu)范圍，不是的話又該如何優(yōu)化。這對于每一個特異性治療都非常重要?！?月6日，王皞鵬教授接受澎湃科技專訪時解釋。
王皞鵬教授是上海科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院的免疫學(xué)專家，研究方向聚焦于T細(xì)胞功能的調(diào)控機制，探索腫瘤免疫療法的新靶點，開發(fā)新型T細(xì)胞免疫療法。王皞鵬的博士后導(dǎo)師是20世紀(jì)90年代初CAR-T的發(fā)明者之一、美國加州大學(xué)舊金山分校（University of California, San Francisco）的亞瑟·韋斯（Arthur Weiss）院士。在他的實驗室里，王皞鵬開始研究T細(xì)胞免疫療法，2015年回國后，王皞鵬一直致力于CAR-T療法的研發(fā)。
CAR-T的困境
CAR-T，即嵌合抗原受體T細(xì)胞（Chimeric Antigen Receptor T Cells），是一種細(xì)胞免疫療法。其具體操作過程是：先由醫(yī)療機構(gòu)采集患者的外周血淋巴細(xì)胞，再送往藥企或?qū)嶒炇?，通過基因修飾技術(shù)將T細(xì)胞改造為可以識別并殺死相應(yīng)腫瘤細(xì)胞的CAR-T，經(jīng)過擴增生產(chǎn)后將CAR-T細(xì)胞通過靜脈輸液方式重新輸回患者體內(nèi)。
王皞鵬介紹，目前，CAR-T療法面臨四個困境?！耙皇荂AR-T在實體腫瘤的治療中舉步維艱，因為實體腫瘤是一個固態(tài)的相對封閉的空間，CAR-T細(xì)胞很難進(jìn)入。二是，實體腫瘤異質(zhì)性顯著。血液腫瘤往往都帶有一個標(biāo)記物，CAR-T細(xì)胞可以通過這個標(biāo)記物很好地感知腫瘤，但是實體腫瘤很難找到一個單一的標(biāo)記物。更麻煩的是，同一個腫瘤里可能有一部分表達(dá)標(biāo)記物A，另一部分表達(dá)標(biāo)記物B，因此，CAR-T細(xì)胞很難精準(zhǔn)地同時感知所有實體腫瘤細(xì)胞。三是CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)持續(xù)時間不夠長，這是導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)的一個重要因素。四是CAR-T細(xì)胞耗竭，就像人不停地去干同一件事情，他的耐心和精力會耗盡一樣，T細(xì)胞不停地重復(fù)識別同一個信號和殺死的動作，它就會進(jìn)入耗竭狀態(tài)?！?/span>
“如果把這四個問題都解決，CAR-T臨床上的兩個難題——血液腫瘤的復(fù)發(fā)和實體腫瘤的低效，都可以隨之解決。” 王皞鵬說。
基底信號傳導(dǎo)可以定義為不依賴于抗原的CAR-T細(xì)胞活化?！癈AR-T細(xì)胞在沒有腫瘤抗原刺激的情況下，也會釋放微弱的、持續(xù)不斷的信號，它可以讓細(xì)胞在體內(nèi)存活的時間比較長?！蓖醢債i解釋，“可以把CAR-T細(xì)胞想象成一輛車，如果總是不啟動，它就容易壞，要時不時啟動一下，它的元件才能保持活性?；仔盘柧褪瞧鸬竭@種怠速作用。我們這次研究的問題就是——‘怠速’形式對于CAR-T來說是不是必要的?！?/span>
2015年，美國國立衛(wèi)生研究院國家癌癥研究所（National Cancer Institute，National Institutes of Health）的一項研究發(fā)現(xiàn)，高基底信號會導(dǎo)致CAR-T細(xì)胞自發(fā)進(jìn)入耗竭狀態(tài)。研究人員將兩種不同基底信號的CAR——一種是基底信號較弱，常用于血液腫瘤的CD19.28z；另一種是基底信號較強，常用于膠質(zhì)瘤的GD2.28z，表達(dá)在細(xì)胞膜上，將CAR和熒光蛋白融合后發(fā)現(xiàn)，CD19.28z CARs均勻分布在T細(xì)胞表面而GD2.28z CARs則形成聚集。當(dāng)研究人員將這兩種CAR注入腫瘤模型時，發(fā)現(xiàn)弱基底信號的CAR-T可以抑制腫瘤，高基底信號的CAR-T則不起作用。
抑制基底信號一度成為業(yè)內(nèi)的共識。然而，2021年，美國賓夕法尼亞大學(xué)（the University of Pennsylvania）的一項研究得出一個截然相反的結(jié)論——高基底信號可增強某些CAR-T細(xì)胞的臨床療效。
“所以這個領(lǐng)域里一直有兩個沒能解決的問題，一是基底信號是如何形成的，二是基底信號到底是強好還是弱好?！蓖醢債i說。
王皞鵬他們就想解決這兩個問題。
解析基底信號的機制
王皞鵬團(tuán)隊首先定量了基底信號的大小——他們制定了一個“基底信號指數(shù)”，“我們把CAR放在一個T細(xì)胞株上，如果產(chǎn)生信號，激活標(biāo)記物（marker）會上調(diào)。標(biāo)記物上調(diào)越多，說明基底信號越強，標(biāo)記物越少，說明基底信號越弱。我們首先觀察了臨床上常用的三種CAR，發(fā)現(xiàn)標(biāo)記物和基底信號指數(shù)呈正相關(guān)，證明我們的模型可用?！蓖醢債i解釋。
隨后，他們用這個細(xì)胞系定義了臨床上常見的十種CAR，產(chǎn)生了三點發(fā)現(xiàn)：第一，在他們的實驗中，觀察的所有CAR都有基底信號；第二，基底信號強弱的范圍非常大；第三，臨床上用于血液腫瘤效果比較好的CAR，基底信號較弱，而用于實體腫瘤的CAR效果較差，基底信號較強。“我們猜想，CAR-T在實體腫瘤中效果不好，很可能是因為基底信號太強，如果減弱它的基底信號，很可能會推進(jìn)CAR-T在實體腫瘤上的治療?！蓖醢債i說。
CAR-T在實體腫瘤中療效有限，T細(xì)胞耗竭是一個很重要的原因。過往的研究表明，高基底信號會導(dǎo)致T細(xì)胞耗竭。為了對這一發(fā)現(xiàn)進(jìn)行驗證，王皞鵬團(tuán)隊定義一個耗竭指數(shù)（exhaustion score）對每種CAR-T的耗竭程度進(jìn)行打分，發(fā)現(xiàn)基底信號越高的CAR-T細(xì)胞越容易耗竭。
在此基礎(chǔ)上，他們開始探究是什么引發(fā)了基底信號。T細(xì)胞受體前體（pre-TCR）已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)具有很強的基底信號。過去有研究者在其表面做了突變，發(fā)現(xiàn)只要消除正電荷，基底信號就會消失，而重新引入正電荷，基底信號也會重新出現(xiàn)。同樣的現(xiàn)象也出現(xiàn)在B細(xì)胞受體前體（pre-BCR）中。這說明，蛋白表面的正電荷在基底信號的形成中起作用。
這啟發(fā)了王皞鵬團(tuán)隊：不同的CAR表面的電荷會不會不同？為了找到這個問題的答案，他們把CAR的正、負(fù)電荷標(biāo)都進(jìn)行了標(biāo)記，觀察發(fā)現(xiàn)，基底信號弱的CAR正負(fù)電荷均勻分布在蛋白表面，而基底信號強的CAR的正電荷會聚集在一起，形成一個斑塊。接著，他們開發(fā)了PCP評分來量化正電荷斑塊的大小，作為基底信號的預(yù)測因子。計算后發(fā)現(xiàn)，斑塊面積越大，基底信號越強。據(jù)此，王皞鵬團(tuán)隊猜想，正電荷的斑塊是讓CAR聚集的動力。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)生較佳基底信號的PCP評分可能在46-56分左右。
兩種優(yōu)化CAR的策略
王皞鵬團(tuán)隊使用了兩種方法來驗證靜電作用對基底信號的影響。第一種是在培養(yǎng)基中加入鹽，鹽會包裹電荷，讓CAR的正電荷的表面帶有負(fù)電荷的氯離子，從而屏蔽了電荷之間的相互作用。他們觀察后發(fā)現(xiàn)，在加入鹽后，基底信號較高的CAR開始在細(xì)胞膜上均勻分布，不再形成聚集，基底信號指數(shù)下降，CAR-T細(xì)胞對腫瘤的殺傷力也提高了一倍?！八晕覀冋J(rèn)為，在培養(yǎng)容易耗竭的CAR-T時，提高鹽濃度，將鹽濃度調(diào)控到較優(yōu)，可以增強CAR-T的功能。”王皞鵬說。
王皞鵬向澎湃科技表示，在培養(yǎng)基中加入鹽的方法有很強的可操作性，因為鹽（氯化鈉）沒有毒性，而且培養(yǎng)基中本身也有鹽，只需調(diào)整它的濃度即可，較大的問題是找到鹽的較優(yōu)濃度。他也坦言，這并不是“治本”的方法，“培養(yǎng)過程中，在鹽的保護(hù)下，T細(xì)胞不耗竭，但在輸入患者體內(nèi)時，T細(xì)胞仍有可能回到耗竭的狀態(tài)?！?/span>
他認(rèn)為能夠“治本”的方法是第二種——通過基因改造減小CAR表面的正電荷斑塊?！拔覀兟匕寻邏K打散，發(fā)現(xiàn)基底信號指數(shù)和耗竭指數(shù)都下降了，對腫瘤的殺傷力也提高了?！蓖醢債i說。
王皞鵬團(tuán)隊的后一步是反證。他們使用在臨床上治療血液腫瘤效果很好的CD19.CAR，希望通過提高它的基底信號，來觀察它的耗竭指數(shù)。然而結(jié)果和他們的假設(shè)相反，在提高了CD19.CAR的基底信號之后，它的功能加強了，更好地清除了腫瘤。這給了王皞鵬團(tuán)隊另一個啟發(fā)：基底信號并不是越低越好?！盎仔盘柡虲AR-T療效之間的關(guān)系是峰形的，較優(yōu)值在中間，而不是兩端。如果基底信號太低，就沒有力量驅(qū)動CAR-T保持怠速活動，導(dǎo)致其持久性不足，如果基底信號太高，它就會驅(qū)動CAR-T‘狂奔’快速地進(jìn)入耗竭狀態(tài)?！蓖醢債i解釋。
“這種方法在體內(nèi)和體外都可行，技術(shù)層面上不難，但需要能夠測量基底信號的體系。相比加鹽，這種方法的前期研發(fā)成本更高，但帶來的收益也相對更高。”王皞鵬向澎湃科技透露，他們計劃把這個體系做成一個網(wǎng)站，只要輸入CAR序列，網(wǎng)站就可以給出調(diào)控基底信號基因改造的方案，使整個過程更加便捷與自動化。
王皞鵬團(tuán)隊一直致力于優(yōu)化CAR的設(shè)計。此前，他們通過研究CAR受體在CAR-T細(xì)胞中轉(zhuǎn)運、降解的調(diào)控機制，設(shè)計了一種可循環(huán)CAR，提高了CAR-T在體內(nèi)的持續(xù)能力，相關(guān)成果于2020年8月發(fā)表于國際期刊《免疫學(xué)》（Immunity）?！斑@是另外一個優(yōu)化CAR的維度，也就是改變CAR受體蛋白的壽命?！蓖醢債i告訴澎湃科技，接下來他們還會繼續(xù)從不同的維度去進(jìn)行CAR的優(yōu)化，“我們希望手上有很多不同維度的‘武器’，看看能否通過某一個維度的優(yōu)化，或通過不同維度優(yōu)化的組合，產(chǎn)生一個較優(yōu)的CAR。
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