mRNA在癌癥治療中的靶向策略與未來方向
脂質(zhì)納米顆粒（LNP）是基于四種脂質(zhì)成分：可電離脂質(zhì)、膽固醇、輔助脂質(zhì)和聚乙二醇（PEG）脂質(zhì)構(gòu)建的脂質(zhì)遞送載體，其具有1）保護核酸有效載荷不被降解或激活RNA傳感機制，進而保護先天免疫反應(yīng)；2）能夠?qū)⒑怂嵊行лd荷引入細胞質(zhì)；3）用于疫苗接種時本身作為佐劑發(fā)揮作用等特性，因而被廣泛應(yīng)用于不同類型的核酸藥物遞送。
利用mRNA-LNP治療癌癥患者一直是十分火熱的研究領(lǐng)域，該領(lǐng)域的發(fā)展甚至遠早于將該技術(shù)應(yīng)用于COVID-19或其他傳染病疫苗的開發(fā)。據(jù)統(tǒng)計，目前該領(lǐng)域的研究主要集中于開發(fā)針對多種新抗原的癌癥疫苗或直接在腫瘤內(nèi)注射編碼促炎細胞因子（例如IL-12）的mRNA-LNP。
目前LNP-mRNA的研究重點主要涉及開發(fā)靶向策略，選擇性地將有效荷載遞送到以前被認為無法達到的細胞類型中，避免在廣泛組織中表達所產(chǎn)生的無效和毒性問題。
2023年8月16日，以色列特拉維夫大學的研究團隊在 Nature 旗下綜述期刊 Nature Reviews Clinical Oncology 上發(fā)表了題為：Targeting cancer with mRNA–lipid nanoparticles: key considerations and future prospects 的綜述論文，概述了使用mRNA-LNP靶向不同癌細胞的各種方法，強調(diào)了每種方法在實現(xiàn)細胞選擇性表達方面的優(yōu)勢和挑戰(zhàn)，以及臨床實踐中所需要克服的問題和未來前景。
被動靶向
被動靶向方法是用于將mRNA-LNP遞送到組織和細胞而不使用靶向修飾表面的方法。在腫瘤免疫治療中，這種方法常用于靶向可觸及的腫瘤以及非惡性組織，例如脾臟和淋巴結(jié)，以實現(xiàn)抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)。
瘤內(nèi)注射
mRNA-LNP的腫瘤內(nèi)給藥是遞送納米顆粒的簡單方法。大多數(shù)腫瘤的脈管系統(tǒng)組織差、缺乏淋巴引流和高細胞外基質(zhì)（ECM）密度，會限制LNP從其他注射部位擴散到腫瘤甚至更深層的腫瘤內(nèi)部。因此，已經(jīng)有多項臨床前研究通過瘤內(nèi)直接注射的方式表達特定細胞因子和細胞毒素，或遞送CRISPR-Cas9介導癌基因靶向
在臨床實踐中，研究人員發(fā)現(xiàn)腫瘤內(nèi)注射的LNP不一定局限于腫瘤區(qū)域。影像學研究表明，腫瘤內(nèi)注射后LNP同樣會在肝臟和淋巴器官中蓄積。其細胞分布在腫瘤細胞群中也有所不同：注射到腫瘤腫塊中并不能保證mRNA主要在癌細胞中表達，導致部分采用直接細胞毒性的療法（例如細胞周期調(diào)節(jié)劑和毒素）出現(xiàn)安全性問題。
臨床前研究表明，大部分mRNA有效載荷均由腫瘤區(qū)域的免疫細胞群表達，特別是巨噬細胞。腫瘤內(nèi)注射的mRNA-LNP療法僅用于表達的目標蛋白在周圍非惡性組織中可耐受或期望的情況。因此，臨床研究中常通過編碼各種細胞因子混合物的mRNA-LNP與免疫檢查點抑制劑聯(lián)合使用作為治療方案。研究還發(fā)現(xiàn)，部分細胞因子（例如IL-12）的局部表達可以改善其全身給藥引起的劑量限制性不良事件，因此目前臨床階段的mRNA-LNP瘤內(nèi)注射候選藥物多采用編碼IL-12的策略。
無論mRNA有效載荷如何，LNP都具有先天佐劑效應(yīng)，可促進CD4 T輔助因子1（T+H1）介導的細胞因子反應(yīng)。TH1反應(yīng)通常是腫瘤抑制性的，而TH2反應(yīng)與細胞介導的免疫力降低和具有癌癥促進表型的免疫群體的激活有關(guān)。研究人員在腫瘤內(nèi)向小鼠施用編碼細胞因子（包括但不限于IL-12IL-15和IL-36γ）的mRNA-LNP，改造腫瘤微環(huán)境（TME）。該表型支持CD8和T+H1細胞的活化，募集自然殺傷（NK）和自然殺傷T（NKT）細胞，以及激活CD103和CD8樹突狀細胞（DC），通過抗原交叉呈遞和激活CD8 T細胞反應(yīng)。
在小鼠中局部施用mRNA-LNP免疫療法觀察到的一個重要特征是，腫瘤內(nèi)注射產(chǎn)生足以抑制轉(zhuǎn)移瘤在注射區(qū)域外擴散的免疫反應(yīng)，在腫瘤內(nèi)注射編碼IL-12或IL-15 mRNA-LNP的小鼠模型中還觀察到未注射遠端的病變消退。
腫瘤內(nèi)注射的mRNA-LNP免疫療法提供了一個操縱TME以促進抗腫瘤免疫應(yīng)答的策略，并使具有過度毒性的細胞因子的局部表達成為可能。盡管如此，這種方法的使用僅限于可觸及的實體腫瘤以及癌細胞外的非惡性組織具有耐受性的情況。
內(nèi)源性靶向
為了到達腫瘤部位，靜脈注射的mRNA-LNP必須安全地通過血管系統(tǒng)，避免全身循環(huán)清除，滲透到腫瘤組織內(nèi)部并遞送到癌細胞內(nèi)。這些階段中的每一個都包含多種屏障，這些屏障也取決于疾病狀態(tài)和腫瘤結(jié)構(gòu)。
PEG脂質(zhì)能夠賦予納米顆粒逃避網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的攝取的能力以及穩(wěn)定性，延長循環(huán)時間。然而，高比例的PEG脂質(zhì)可能會阻止細胞的攝取，此外，抗PEG抗體也會促進LNP的加速血液清除。因此研究人員也在PEG脂質(zhì)的潛在替代方案上做出了努力，但目前PEG脂質(zhì)仍是有效的LNP穩(wěn)定成分。
通常靜脈注射LNP會迅速吸附血清蛋白，在全身給藥后積聚在肝臟中。其中，載脂蛋白E（ApoE）包被的LNP通過與LDL受體結(jié)合能夠進一步促進肝細胞攝取。準確預測血清蛋白吸附在LNP上形成的蛋白冠以及該過程如何影響LNP的生物分布被稱為內(nèi)源性定位。
一些研究報道，LNP改變需要限制在與尺寸，均勻分布和表面電荷有關(guān)的可接受的理化特性范圍內(nèi)，例如LNP表面的負電荷可以阻止其在肝臟的富集，而正電荷通過激活免疫細胞中TLR4介導的信號通路而具有全身毒性的風險。
不同配方的生物分布差異，以及脂質(zhì)制劑、結(jié)構(gòu)和活性之間的一般關(guān)系仍有待充分了解。優(yōu)化不同組織內(nèi)源性靶向配方的研究集中在體外和體內(nèi)的篩選上，這些篩選通常使用報告基因觀察LNP的生物分布。DNA條形碼對LNP報告基因的組織分布進行逆向工程，以確定某些組織中mRNA-LNPs內(nèi)源性被動攝取的機制。然而DNA條形碼常用的DNA-LNP不一定具有與mRNA-LNP相同的分布。
使用配方優(yōu)化設(shè)計的靶向策略通常能夠被某些器官優(yōu)先攝取，但很少能實現(xiàn)高水平的靶細胞特異性表達。
臨床實踐經(jīng)驗表明，根據(jù)腫瘤類型和患者個體的不同，LNP的攝取存在相當大的異質(zhì)性。同時，這些納米顆粒并不總是吸附蛋白質(zhì)，因此它們的生物分布（主要由大小決定）可能無法反映治療性mRNA-LNP的生物分布。不僅如此，靜脈注射的mRNA-LNPs通常表現(xiàn)出在高細胞密度和組織液壓力的冷腫瘤中滲透性不佳。
因此，全身給藥的納米載體藥物其治療潛力和機制仍有待更好地研究。已有研究依靠被動靶向?qū)⒕幋a的抗原遞送到DC，利用其強大抗原呈遞功能激活機體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。后續(xù)的內(nèi)源性靶向研究也很可能將集中在免疫細胞攝取，如淋巴器官或骨髓，通過激活抗原呈遞、白細胞或抗腫瘤蛋白實現(xiàn)免疫治療。
主動靶向
主動靶向被許多人認為是藥物遞送領(lǐng)域的圣杯。mRNA-LNPs的主動靶向涉及通過用從小分子配體到單克隆抗體的靶向部分修飾納米顆粒的表面來遞送到特定的細胞類型。當針對癌細胞時，主動靶向方法可以促進細胞對mRNA-LNP的攝取，這對于核酸有效載荷的表達至關(guān)重要。當針對非惡性細胞時，主動靶向方法可以將mRNA遞送到原本不太可能攝取LNP的細胞中，例如淋巴細胞，激活機體抗腫瘤免疫。
靶點選擇
癌細胞直接靶向的理想靶標是腫瘤特異性抗原（TSA），通過結(jié)合可激活迅速內(nèi)化的分子使核酸有效荷載進入癌細胞內(nèi)。然而，鑒于TSA很少見，研究中也會采用結(jié)合多個高表達的腫瘤相關(guān)抗原（TAA）作為備選方案。
在考慮可能的靶標時，應(yīng)解決靶向配體的活性和相互作用的潛在生物學效應(yīng)問題。例如，用于將mRNA遞送到T細胞的CD3靶向mRNA-LNP已被證明具有不良反應(yīng)，由于潛在的過度活化和T細胞耗竭，不受控制的T細胞活化可能是有害的。
解決腫瘤和患者的異質(zhì)性也存在許多問題。例如，HER2是一種常見的乳腺癌生物標志物，但僅存在于15-20%的這類癌癥患者中，其表達水平可能在同一腫瘤內(nèi)的細胞之間都有所不同。此外，某一特定靶標的表達可以在不同的疾病階段波動，例如某些靶標的細胞外結(jié)構(gòu)域會在炎癥期間從膜上裂解或脫落，或者在翻譯后獲得不同的修飾。據(jù)報道，MET（一種已知的癌癥靶點）的結(jié)構(gòu)域脫落增加與各種癌癥類型的疾病進展相關(guān)。同樣的，HER2表達水平隨疾病進展和復發(fā)而變化，并且在復發(fā)性疾病中，HER2從陰性變?yōu)榈捅磉_。
腫瘤相關(guān)抗原（TAA）靶向策略可以通過調(diào)整抗原表位和抗體分子的親和力改進。然而，高親和力靶向相互作用可導致結(jié)合位點屏障現(xiàn)象，納米顆粒傾向于粘附在靶標組織外表達抗原的第一層細胞上。
細胞內(nèi)化
鑒于RNA療法必須到達細胞質(zhì)才能執(zhí)行其功能，內(nèi)化和內(nèi)體逃逸對于mRNA-LNP的活性至關(guān)重要。大多數(shù)關(guān)于靶向和內(nèi)化的數(shù)據(jù)來自抗體-藥物偶聯(lián)物（ADC）的研究。使用這些數(shù)據(jù)了解受體內(nèi)化率是一個很好的開始起點，盡管適用于ADC的特征不一定適用于mRNA-LNP，后者通常比前者尺寸大。然而，對于ADC和mRNA-LNPs，內(nèi)化速率似乎都與有效荷載釋放呈正相關(guān)。
需要注意的是，目前對靶標、靶向配體及其相互作用的研究仍不足以預測內(nèi)化機制。靶向抗體可以在與受體結(jié)合后內(nèi)化，而受體不一定在與其天然配體相互作用時內(nèi)化。根據(jù)抗體修飾和復合物大小的不同，蛋白介導的內(nèi)化可能會轉(zhuǎn)變?yōu)榫薨嬜饔?。此外，如果抗體未內(nèi)化，它們還可能觸發(fā)原本的功能效應(yīng)，例如巨噬細胞中抗體依賴性細胞毒性和其他Fc區(qū)域觸發(fā)的活動。由于所有這些考慮，除了篩選之外，對靶向相互作用、其在疾病中的機制以及經(jīng)驗證據(jù)的深刻生物學理解對于有效的靶向設(shè)計至關(guān)重要。
結(jié)合抗體的mRNA-LNP設(shè)計
目前有兩種主要方法可用于LNP表面的靶向抗體修飾。
第一種方法在LNP制劑中加入“錨定”脂質(zhì)，在顆粒制備后可以與功能配體綴合（圖2a）。常用的錨定脂質(zhì)包括磷脂酰乙醇胺、PEG-馬來酰亞胺和磷脂酰肌醇，可與靶向抗體化學偶聯(lián)。該方法能夠通過調(diào)整錨定脂質(zhì)的摩爾質(zhì)量來控制LNP上存在的靶向部分的數(shù)量。然而，該方法也可能產(chǎn)生偶聯(lián)不完整或靶向不正確的抗體，例如具有暴露于Fc區(qū)域的定向抗體，這可能導致不需要的免疫反應(yīng)并影響藥代動力學特征和分布。此外，這種策略效率低下，導致多清除途徑對未結(jié)合部分的清除。
第二種策略涉及LNP制劑制備，然后通過優(yōu)化共孵育將疏水性抗體衍生物（例如脂質(zhì)-配體偶聯(lián)物）插入到預成型的LNP中。這種方法不需要LNP配方中的反應(yīng)性錨定脂質(zhì)，并且可以更好地控制抗體-脂質(zhì)偶聯(lián)。已有研究報道，該方法可以更好地保留LNP的原始理化性質(zhì)，并成功將mRNA有效載荷遞送到小鼠中的特定免疫細胞群和癌細胞。
盡管主動靶向已經(jīng)獲得了廣泛的研究，然而同被動靶向一樣存在的類似問題，如實體瘤的滲透仍未得到妥善解決。
臨床實踐與問題
開發(fā)癌癥疫苗的研究項目正試圖同時編碼多種抗原，從而提供個性化疫苗。這種疫苗依賴于mRNA治療平臺的優(yōu)勢：其模塊化、包封大量有效載荷的能力以及生產(chǎn)速度。Moderna適用LNP系統(tǒng)的mRNA-4157腫瘤疫苗可以在編碼多表位的單個mRNA連接體中編碼多達34個新抗原，通過編碼切割敏感位點穿插的短表位連接體（short epitope concatemers）來實現(xiàn)。
個性化癌癥疫苗需要高速的產(chǎn)品生產(chǎn)。據(jù)報道，從患者來源的腫瘤樣本測序到個性化疫苗的生產(chǎn)和給藥時間可以縮短至30-40天。與基于小分子或蛋白質(zhì)的療法不同，大多數(shù)mRNA有效載荷僅在核苷酸序列上有所不同，因此可以快速進行個性化生產(chǎn)。此外，mRNA-LNP可以通過傳統(tǒng)方式以外的各種途徑進行給藥，例如通過超聲成像引導的腹股溝淋巴注射。
臨床中還普遍關(guān)注重復注射導致的LNP免疫原性和耐受性，以及組織中的脂質(zhì)積累。從目前主要的幾項腫瘤疫苗臨床實驗和FDA等監(jiān)管的反應(yīng)來看，在當前的開發(fā)階段mRNA-LNP腫瘤免疫療法對這些患者的益處被認為超過了潛在的缺陷。
除了免疫原性之外，其他研究還顯示mRNA-LNP遞送在小鼠，非人靈長類動物和人類中是不同的。研究表明，mRNA-LNP疫苗誘導人類分泌IL-1，而在小鼠中上調(diào)了IL-1受體拮抗劑蛋白，出現(xiàn)差異性激活。小鼠、非人靈長類和人類之間的這些差異可能反映了其他尚未揭示的機制作用，應(yīng)該在未來的研究中進一步探索。
未來研究方向
mRNA–LNP除了改進靶向策略外，還面臨著一些挑戰(zhàn)。挑戰(zhàn)之一是mRNA-LNP在冰箱溫度或室溫下的不穩(wěn)定性，這被認為是由mRNA本身的不穩(wěn)定性引起的，而不是LNP載體的不穩(wěn)定性。其次，LNP不是惰性的，可能增加宿主中的細胞因子水平引起炎癥。雖然這種類似佐劑效應(yīng)的特性可能對免疫治療有益，但存在mRNA–LNP給藥后補體激活相關(guān)的假性過敏反應(yīng)。此外，在接種過基于mRNA-LNP的COVID-19疫苗的個體中檢測到抗PEG抗體。對于需要重復給藥的方案，這些抗PEG抗體可能導致LNP的快速清除，從而阻礙治療效果。
有意思的是，mRNA序列的可編程設(shè)計也被用于細胞特異性翻譯，可以通過操縱mRNA分子的結(jié)構(gòu)動力學激活特定細胞內(nèi)的翻譯。一些方法利用mRNA 5′非翻譯區(qū)（UTR）中的反應(yīng)性3D結(jié)構(gòu)，可以在靶細胞中差異存在的分子和/或序列存在的情況下激活或阻止翻譯起始，例如依靠IRES啟動翻譯。此外，細胞類型之間獨特的tRNA表達模式可用于在不同細胞群和/或組織中以不同的速率翻譯序列。細胞特異性microRNA（miRNA）的結(jié)合序列可以摻入UTR中，以影響不同細胞群的降解速率（圖3a）。
改善mRNA-LNP靶向的另一種方法將依賴于更好地了解影響不同LNP制劑生物分布的因素。具體而言，不同可電離脂質(zhì)成分結(jié)構(gòu)與某些器官和細胞分布趨勢之間的構(gòu)效關(guān)系需要更好的機理表征（圖3b）。
總結(jié)
在過去的幾年中，使用被動或主動方法將mRNA-LNP靶向腫瘤進行免疫治療取得了有希望的進展。任何一種方法的選擇通常取決于易于生產(chǎn)和特異性之間的折中。針對特定惡性腫瘤的靶向策略常涉及諸如是否已確定腫瘤可靶向特征、腫瘤內(nèi)注射的可行性以及轉(zhuǎn)移傾向等因素。該決定還應(yīng)考慮到不同有效載荷、脫靶毒性以及特定表達對治療效果的綜合影響。
CMC工藝上的限制雖然有時在藥物療法設(shè)計過程中被忽視并推遲到藥物開發(fā)過程的后期階段，但理應(yīng)盡早解決。事實上，CMC生產(chǎn)的考慮因素對于臨床實施所需的大規(guī)模生產(chǎn)藥物至關(guān)重要。
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