2024年1月5日，復(fù)旦大學(xué)張文宏及陳嘉臻等團(tuán)隊(duì)合作在 《mBio》 在線發(fā)表題為“Mutations in the promoter region of methionine transporter gene metM (Rv3253c) confer para-aminosalicylic acid (PAS) resistance in Mycobacterium tuberculosis”的研究論文，該研究發(fā)現(xiàn)甲硫氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)基因metM (Rv3253c)啟動(dòng)子區(qū)域突變導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌對(duì)氨基水楊酸(PAS)產(chǎn)生耐藥性。
研究背景
結(jié)核病仍然是對(duì)全球公共衛(wèi)生的巨大威脅，是2019年冠狀病毒?。–OVID-19）大流行爆發(fā)前單一傳染性病原體死亡的主要原因，其致死率甚至超過(guò)了艾滋病毒/艾滋病。僅在2020年，估計(jì)就報(bào)告了990萬(wàn)新發(fā)結(jié)核病病例，相當(dāng)于每10萬(wàn)人中有127例。耐多藥結(jié)核?。∕DR-TB）或利福平耐藥結(jié)核病在新診斷患者中的患病率約為3%-4%，在既往有治療史的患者中約為18%-21%。對(duì)氨基水楊酸（PAS）于 1946 年首次用于結(jié)核病治療，現(xiàn)已成為二線抗結(jié)核藥物。鑒于耐多藥結(jié)核病的增加，在強(qiáng)化治療階段，PAS經(jīng)常作為C組藥物納入耐多藥結(jié)核病治療方案。
雖然 PAS 與鏈霉素聯(lián)合用于減少耐藥結(jié)核病的出現(xiàn)可以追溯到 1952 年，但耐藥性的確切機(jī)制仍然難以捉摸。
研究設(shè)計(jì)
在這項(xiàng)研究中，我們進(jìn)行了一項(xiàng)體外實(shí)驗(yàn)，使用 7H11 培養(yǎng)基誘導(dǎo) MTB 的 PAS 耐藥性，并鑒定了賦予 PAS 耐藥性的新突變。通過(guò)全基因組測(cè)序（WGS）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）、β-半乳糖苷酶測(cè)定和基因過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)，我們揭示了7H11培養(yǎng)基中PAS耐藥的新機(jī)制，該機(jī)制與編碼蛋氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的metM啟動(dòng)子區(qū)域突變有關(guān)，當(dāng)使用缺乏蛋氨酸的7H10固體培養(yǎng)基時(shí)，這種機(jī)制很可能被忽視，從而為MTB中PAS耐藥的機(jī)制提供了新的思路。
在臨床菌株中檢測(cè)到metM啟動(dòng)子突變
我們從公共數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選了臨床MTB分離株中metM和Rv3254基因間區(qū)域的突變，發(fā)現(xiàn)了12種不同的突變。雖然我們無(wú)法在公共數(shù)據(jù)庫(kù)中確認(rèn)臨床菌株的PAS耐藥性，但在實(shí)驗(yàn)室（P61）和臨床菌株（UM200902T0099）中都觀察到同一位點(diǎn)（C-42T）的突變。metM啟動(dòng)子突變體聚集在兩個(gè)熱點(diǎn)區(qū)域，即-42至-39和-59至-57，表明這兩個(gè)區(qū)域在增加metM啟動(dòng)子活性方面可能具有重要意義（圖8）。
實(shí)驗(yàn)室和臨床菌株中metM啟動(dòng)子突變的相對(duì)位置示意圖
研究意義
盡管對(duì)氨基水楊酸（PAS）用于治療結(jié)核病已有70多年的歷史，但對(duì)PAS耐藥機(jī)制的理解仍然模糊，我們?cè)陬A(yù)測(cè)耐藥性和在臨床實(shí)踐中有效應(yīng)用PAS的能力存在差距。本研究旨在通過(guò)使用 7H11 培養(yǎng)基誘導(dǎo)結(jié)核分枝桿菌 （MTB） 體外 PAS 耐藥并發(fā)現(xiàn)一種新的 PAS 耐藥機(jī)制來(lái)解決這一知識(shí)空白。
我們的研究表明，甲硫氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)基因 metM 的啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生的自發(fā)突變可以上調(diào) metM 的表達(dá)，導(dǎo)致甲硫氨酸的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)增加，從而提高結(jié)核分枝桿菌對(duì) PAS 的高水平耐藥性。值得注意的是，當(dāng)使用通常推薦的 7H10 培養(yǎng)基時(shí)，無(wú)法觀察到這種耐藥表型，這可能是由于與使用 7H11 培養(yǎng)基相比缺乏額外的蛋氨酸供應(yīng)。在一些臨床MTB菌株中也發(fā)現(xiàn)了metM調(diào)控區(qū)的突變。這些發(fā)現(xiàn)可能對(duì)臨床環(huán)境中觀察到的無(wú)法解釋的 PAS 耐藥性具有重要意義，并提供了對(duì) PAS 治療失敗的見(jiàn)解。此外，他們還強(qiáng)調(diào)了在進(jìn)行MTB藥敏試驗(yàn)時(shí)考慮培養(yǎng)基選擇的重要性。
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