8月26日，武漢大學(xué)周蕊/肖睿璟研究團隊在期刊《Cell Death&Disease》上發(fā)表了研究論文，題為“KHSRP ameliorates acute liver failure by regulating pre-mRNA splicing through its interaction with SF3B1”，研究人員在小鼠ALF模型中，利用蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，多種剪接因子在ALF中的表達(dá)下調(diào)。值得注意的是，研究人員發(fā)現(xiàn)KH型剪接調(diào)節(jié)蛋白(KHSRP)對ALF有保護作用。敲低KHSRP導(dǎo)致嚴(yán)重的剪接缺陷，如內(nèi)含子保留，并導(dǎo)致ALF中肝損傷的惡化。此外，研究人員證明KHSRP直接與剪接因子3b亞基1(SF3B1)相互作用，增強SF3B1與內(nèi)含子支架位點的結(jié)合，從而促進(jìn)前體mRNA的剪接。使用剪接抑制劑，研究人員發(fā)現(xiàn)Khsrp在體內(nèi)通過調(diào)節(jié)前體mRNA剪接來保護免于ALF?？傊?，研究結(jié)果表明，KHSRP是一種重要的剪接激活劑，通過與SF3B1相互作用促進(jìn)與ALF進(jìn)展相關(guān)的基因表達(dá)，因此KHSRP可能是ALF治療干預(yù)的潛在靶點。
背景知識
急性肝功能衰竭（ALF）是一種急性肝功能緊急情況，死亡率很高。在ALF中，肝細(xì)胞功能的迅速惡化可導(dǎo)致肝性腦病、腦水腫、凝血障礙、感染和多器官功能障礙綜合征。ALF的原因包括病毒性肝炎（甲型、乙型和戊型）和藥物引起的肝毒性，如對乙酰氨基酚（APAP）。ALF的治療主要限于支持性護理和緊急肝移植。因此，迫切需要開發(fā)新的治療策略。在ALF期間，肝細(xì)胞死亡通常會誘導(dǎo)補償性細(xì)胞增殖，可以恢復(fù)肝臟質(zhì)量并防止器官功能喪失；然而，當(dāng)肝細(xì)胞死亡的程度超過肝臟的再生能力時，ALF會惡化。到目前為止，ALF的分子機制仍不清楚。
前體mRNA剪接是具有內(nèi)含子基因表達(dá)過程中必不可少的一個事件。它是由五種snRNAs和100多種相關(guān)蛋白質(zhì)組成的剪接復(fù)合物（spliceosome）完成的。snRNAs與幾種蛋白質(zhì)結(jié)合形成小核核糖核蛋白復(fù)合物（snRNPs），并動態(tài)地組裝成剪接復(fù)合物。U2 snRNP識別分支點（BS）并與U2AFs相互作用，以定義每個內(nèi)含子的3'剪接位點，從而在早期階段組裝剪接復(fù)合物。隨后，它在剪接催化中起著關(guān)鍵作用。SF3b是17S U2 snRNP的最大組分，包含SF3B1、SF3B2、SF3B3、SF3B4、SF3B5、SF3B6和PHD指紋蛋白5A（PHF5A）。此外，SF3b穩(wěn)定U2 snRNA/BS相互作用，在剪接過程中在BS識別和選擇中發(fā)揮關(guān)鍵作用。SF3B1是最大的SF3b亞基，它在內(nèi)含子BS區(qū)域兩側(cè)的預(yù)mRNA上結(jié)合并交叉連接。
目前越來越多的證據(jù)表明，異常剪接與許多疾病密切相關(guān)，包括骨髓增生異常綜合征和急性髓細(xì)胞白血病。調(diào)節(jié)前體mRNA剪接的藥物療法正逐漸成為一種有前途的癌癥治療策略。一項研究發(fā)現(xiàn)，上皮剪接調(diào)節(jié)蛋白2（ESRP2）能夠協(xié)調(diào)許多與細(xì)胞增殖相關(guān)的基因的剪接，包括Hippo信號通路的核心成分；因此，該研究揭示了肝細(xì)胞適應(yīng)損傷的可能機制。這些發(fā)現(xiàn)表明，前體mRNA剪接紊亂在肝病中起作用；然而，前體mRNA剪接紊亂在肝病，尤其是ALF中的分子機制和功能相關(guān)性仍不清楚。
急性肝功能衰竭患者中預(yù)剪接RNA剪接因子表達(dá)降低
研究人員對CCl4挑戰(zhàn)小鼠的肝臟進(jìn)行了RNA-Seq分析，RNA-Seq數(shù)據(jù)的生物重復(fù)樣本顯示良好的一致性。CCl4處理后，研究人員鑒定出3867個下調(diào)基因和2869個上調(diào)基因。GO分析顯示，下調(diào)基因高度富集于RNA降解過程，與蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)一致。在下調(diào)基因中，Khsrp、Sf3b1、Sf3a1和Phf5a在CCl4挑戰(zhàn)小鼠中的mRNA表達(dá)也降低了。實時PCR證實，在APAP處理的小鼠中，Khsrp、Sf3b1、Sf3a1和Phf5a的表達(dá)也降低了。此外，先前發(fā)表的來自ALF患者和對照受試者肝臟的全基因組表達(dá)譜數(shù)據(jù)證實，包括KHSRP、SF3A1、U2AF2和HNRNPU在內(nèi)的若干剪接相關(guān)因子在ALF中的表達(dá)低于對照組。這些結(jié)果表明，前mRNA剪接因子的變化與ALF有關(guān)。值得注意的是，研究人員發(fā)現(xiàn)KHSRP的表達(dá)水平降低，KHSRP已被報道為一種剪接因子，在非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）、肝細(xì)胞癌（HCC）和血吸蟲病引起的肝纖維化中表現(xiàn)出表達(dá)水平的變化。
為了確定PB是如何逆轉(zhuǎn)Khsrp介導(dǎo)的肝臟保護作用的，研究人員觀察了Khsrp表達(dá)載體處理組的肝細(xì)胞增殖（KI67）和凋亡（TUNEL染色）情況，并比較了PB存在與否的影響。CCl4處理增加了KI67的表達(dá)和凋亡細(xì)胞的數(shù)量，與先前的研究結(jié)果一致。Khsrp過表達(dá)進(jìn)一步增加了KI67的表達(dá)并抑制了肝細(xì)胞的凋亡，表明它減輕了肝臟損傷。然而，PB注射降低了Khsrp過表達(dá)小鼠中KI67的表達(dá)水平并增加了凋亡細(xì)胞的數(shù)量。這些數(shù)據(jù)表明，PB在Khsrp過表達(dá)小鼠中加劇了肝臟損傷并抵消了Khsrp的保護作用。
研究結(jié)果表明，KHSRP促進(jìn)EGFR的剪接。EGFR信號傳導(dǎo)已被證明可保護肝臟免受膽汁淤積性損傷和纖維化。因此，研究人員使用Egfr來研究Khsrp過表達(dá)是否通過pre-mRNA剪接減輕小鼠的肝損傷。為了處理EGFR信號，研究人員使用了癌癥治療藥物鹽酸厄洛替尼，一種EGFR相關(guān)酪氨酸激酶的抑制劑。厄洛替尼處理HL7702細(xì)胞后，EGFR信號通路相關(guān)基因EGFR、EGF、ERBB2和ERBB4的表達(dá)水平下調(diào)。免疫組化結(jié)果顯示，Khsrp過表達(dá)增加了EGFR的表達(dá)，而厄洛替尼注射顯著降低了EGFR的表達(dá)水平?？诜蚵逄婺岷螅琄hsrp過表達(dá)組小鼠肝壞死面積增大，血清ALT、AST活性升高，KI67表達(dá)降低，肝細(xì)胞凋亡增多。
Khsrp通過調(diào)節(jié)pre-mRNA剪接發(fā)揮抗ALF作用
研究小結(jié)
在本研究中，體外和體內(nèi)證據(jù)充分表明，KHSRP通過調(diào)節(jié)pre-mRNA剪接在ALF中起著至關(guān)重要的作用。數(shù)據(jù)表明，KHSRP通過與SF3B1的相互作用來調(diào)節(jié)pre-mRNA的剪接，這是一種以前未報道的機制。因此，研究人員揭示了肝臟細(xì)胞可能用于保護免受急性肝病侵害的新途徑。此外，研究發(fā)現(xiàn)表明，KHSRP介導(dǎo)的前體mRNA剪接調(diào)控可能代表了ALF調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中一個新的機制，這可能對開發(fā)新的治療策略具有重要意義。
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